Sephadex葡聚糖凝膠柱使用及注意事項(xiàng)
1 Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，Sephadex G-25羥丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子篩作用，在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價(jià)位很高，但由于性能頗佳，可再生利用，所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少，對(duì)處理小樣品較好，這也是我們實(shí)驗(yàn)室常用的原因之一。
2 Sephadex LH-20 的分離原理。
Sephadex LH-20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過(guò)濾作用為主，兼具反相分配的作用(在反相溶劑中)。因?yàn)槟z過(guò)濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，小分子的化合物保留強(qiáng)，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH-20對(duì)化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過(guò)濾作用來(lái)分離。
3 Sephadex LH-20 洗脫溶劑。
看完第2點(diǎn)后，就應(yīng)該清楚Sephadex LH-20 洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇--水系統(tǒng)最為常見(jiàn)，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100%甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿--甲醇最為常見(jiàn)，先用50%氯仿--甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100%甲醇沖柱。
4 Sephadex LH-20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。
如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫(甲醇--水)，樣品用最少體積的甲醇--水(盡可能甲醇少一些)溶解，過(guò)濾后，濕法上樣(一定要濾喔!要是把Sephadex LH-20 堵啦，就得將Sephadex LH-20 的柱頭部分棄去，很心痛呀)。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫(氯仿--甲醇)，樣品用最少體積的氯仿--甲醇溶解，過(guò)濾后，濕法上樣。
5 Sephadex LH-20的步驟。
(1) 選擇條件：
梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。
(2) 飽和層析柱：
用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時(shí)要防止氣泡留在其中。至少半小時(shí)打開(kāi)開(kāi)關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。
(3) 樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過(guò)濾。
(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。
(5) 洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見(jiàn)廠家的一些參數(shù);必要時(shí)更改極性(很多時(shí)一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢)。
再生以備下次使用。
6 分離的技巧：
(1) 流速不可太快，切切不可著急，所謂欲速則不達(dá)。
(2)盡可能用長(zhǎng)柱， Sephadex LH-20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離，所以不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢(shì)兵力，打擊敵人。
(3) 餾分一定要接的細(xì)，可1/10，或1/20 個(gè)保留體積接成一餾分。
(4) 洗脫體積一般為2-3個(gè)保留體積，對(duì)特殊保留強(qiáng)的化合物，可洗脫5個(gè)保留體積。
(5)鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，如不在乎填料者，可用 Sephadex LH-20 分鞣質(zhì)
(6)Sephadex LH-20 對(duì)黃酮類成分的分離效果**，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。
(7)填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來(lái)，待用。
Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等，Sephadex LH-20同時(shí)適用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于最終精制步驟，如非對(duì)映同分異構(gòu)體的分離。
1. 裝柱
裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一(粒徑分布越窄)，越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒徑范圍相對(duì)于許多用于制備色譜的填料而言，不能說(shuō)分布均一，也就是說(shuō)其粒徑分布較寬。然而當(dāng)膠溶脹后就相對(duì)容易得到均一的柱床。這對(duì)于長(zhǎng)柱(最高至250cm)而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲(chǔ)槽都必須進(jìn)行徹底的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過(guò)程中，要盡量避免過(guò)分?jǐn)嚢?，否則會(huì)破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。
在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請(qǐng)參考后頁(yè)之干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠?？梢苿?dòng)。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過(guò)1.5ba。
2.平衡
上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)，并根據(jù)性質(zhì)確定柱高調(diào)節(jié)器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。
3.洗脫液
為確保延長(zhǎng)層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過(guò)0.45um的膜過(guò)濾以除去雜質(zhì)。
4.樣品
樣品體積應(yīng)該占柱總體積的 1-2%，同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過(guò)0.45um的膜過(guò)濾。
5.洗脫
洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，最大線性流速約 12cm/min(反壓1.5ba)，建議流速為1-10cm/h?？傮w來(lái)說(shuō)，較低的流速，具有較高的分辯率。
6. 再生
凝膠色譜柱的再生通常是先用2-3個(gè)柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗，如更換洗脫液，則需要重新平衡。
7.體積流速與線性流速的關(guān)系
線性流速=體積流速/橫截面積
8.溶脹體積
由于Sephadex LH-20的溶脹體積依賴于溶劑，所以對(duì)于不同直徑的柱可根據(jù)比例增加或減少舊柱體積以便計(jì)算出新體積。
新體積=舊體積×(新柱體積/舊柱體積)
9.膠的性質(zhì)
Sephadex LH-20同時(shí)具備親水和親脂雙重性質(zhì)，且被分離物質(zhì)的極性在分離過(guò)程中起著重要作用。
10. 排阻極限 4-5KD(與所用溶劑有關(guān))
11.上樣量
吸附模式取決于所需分辯率
分子量大小小于總體積的20%
正相分配小于總體積的1%
12.其他
膠粒形狀球形，多孔
顆粒大小(干) 18-111um(直徑)
顆粒大小中間值(干) 70um(直徑)
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